Проверить текст на вхождение ключевых слов в режиме онлайн

Особенности выделения ДНК из разных типов образцов

Введение

Одной из основных причин увеличения темпов развития медицины, стало появление возможности секвенировать последовательность ДНК и добраться до истоков возникновения патологии. Стремительный прогресс в отрасли постоянно приводит к появлению новых методов анализа, работы с образцами и подходов к определению последовательности. Это может быть секвенирование нового поколения, или просто NGS, или "золотой" стандарт — секвенирование по Сэнгеру. Для каждого из подходов характерны свои особенности, это могут быть модификации в подготовке библиотеки, таргетное обогащение или определенные пайплайны биоинформатического анализа. Однако, не стоит забывать, что успех всего процесса работы с нуклеиновыми кислотами во многом заключается в том, насколько много и какого качества удастся выделить ДНК или РНК из исходного образца. Выделение нуклеиновых кислот может быть самым простым и рутинным этапом работы для сотрудника лаборатории, который воспользуется одной методикой проверенной сто раз. Или придется в прямом смысле импровизировать и комбинировать разные подходы. Фрагмент кости неандертальца, ткань растения с обилием эфирных масел в своем составе, неуловимые вирусные частицы или образец воздуха в школьной столовой. Каждый объект уникален, к каждому нужен свой подход, оттого порой и встречаются трудности на самом первом лабораторном этапе работы с полученными образцами — экстракции ДНК. А ведь впереди еще секвенирование ! Давайте разберемся, откуда может быть извлечена ДНК, зачем и, самое главное, как ?

Основные принципы выделения нуклеиновых кислот

Внутри клеток любого из организмов на планете есть носитель наследственной информации — ДНК или РНК. ДНК представляет собой сложную молекулу, которая содержит всю информацию, необходимую для построения и поддержания жизни. Экстракция ДНК является одним из самых основных и важных методов генетического исследования, позволяющим добиться огромных успехов в лабораториях молекулярной биологии, биотехнологии и биоинформатики [ 1 ]. Каким бы ни был объект из которого необходимо выделить ДНК — растительная или животная клетка, вирус, бактерия, окаменевшая или мумифицированная ткань, общими для всех источников нуклеиновых кислот будут три этапа выделения [ 2 ]:

1. Лизис — нарушение цитоплазматических и ядерных мембран.
2. Очистка ДНК от других компонентов клеточного лизата, таких как липиды, белки и другие нуклеиновые кислоты. ДНК отделяется от лизата двумя основными подходами — при помощи химического агента, например фенол-хлороформа, который связывает белки, что позволяет отделить их от нуклеиновых кислот, или при помощи твердых материалов — фильтровальной бумаги, мембраны из силиката, магнитных шариков, полимерных смол или наноматериалов.
3. Элюирование — отделение ДНК от других веществ и последующее ее концентрирование. Для этого используют увеличение pH раствора примерно до 8 [ 3 ].

Некоторые производители предусмотрели специфику выделения в зависимости от объектов, так наборы наборы для выделения Raissol представляют широкий спектр решений для выделения ДНК в зависимости от задач.

Выделение нуклеиновых кислот из тканей животных и человека

Генетический анализ стал неотъемлемой частью многих медицинских процедур, от диагностики заболевания до индивидуального подбора наиболее эффективной терапии. Такое стремительное развитие отрасли привело к закономерному увеличению возможных подходов к работе с генетическими данными. Но сперва, чтобы их получить, необходимо выделить ДНК. Получение ДНК животных и человека возможно из разных типов тканей, каждый из которых имеет свои особенности, так можно экстрагировать нуклеиновые кислоты из:

• сыворотки крови;

• плазмы крови. Методом сорбции на магнитных частицах со специально разработанным буфером, который способствует связыванию коротких фрагментов ДНК на силикатной матрице и препятствует связыванию с ней белков;

• • цельной крови. Кровь является распространенным источником выделения ДНК, и обычно ее обрабатывают путем центрифугирования для отделения эритроцитов от лейкоцитов. Затем белые кровяные клетки лизируются с помощью реагентов, содержащих ферменты, которые денатурируют белки и высвобождают геномную ДНК. Полученный раствор может подвергаться дальнейшим этапам очистки в зависимости от области применения. Из цельной крови ДНК экстрагируется методом сорбции на магнитных частицах. При этом используется буфер для удаления красных клеток крови для получения высоких концентраций ДНК;

• клеточных сред, тканей. Такие ткани, как печень, мозг, мышцы и кожа, содержат различное количество ДНК, которую можно выделить с помощью различных протоколов. Например, ткани с высоким содержанием жира, такие как мозг и жировая ткань, могут потребовать дополнительного механического разрушения и экстракции хлороформом для удаления липидов. Ткани также можно разрушить с помощью гомогенизатора или ступки и пестика, а затем подвергнуть ферментативному перевариванию для высвобождения ДНК. Из тканей ДНК экстрагируется методом сорбции на магнитных частицах с использованием оптимизированного под образцы, хранящиеся в спиртовом растворе;

• • буккальных мазков, цервикальных мазков, слюны, мокроты. Методов сорбции на кремниевой мембране спин-колонок;
  • кала. Выделение проводится с использованием магнитных частиц, позволяющих экстрагировать ДНК как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий;
  • амниотической жидкости. Проводится путем тотального спиртового осаждения. Так как количество клеток, содержащих ДНК плода в амниотической жидкости, крайне мало, в метод внесены модификации, способные увеличить выход качественной ДНК для последующего анализа.
  • спинномозговой жидкости;

• мочи;

Фактические протоколы экстракции значительно различаются в зависимости от целей пробоподготовки. Например, для выделения геномной ДНК лейкоциты необходимо отделить от остальных компонентов крови [ 4 ]. Напротив, для обнаружения патогенных нуклеиновых кислот или бесклеточных ДНК перед экстракцией отделяют либо сыворотку, либо зараженные патогеном клетки крови [ 5 ]. Удаление эритроцитов также помогает уменьшить уровень гемоглобина, который является одним из основных источников ингибиторов последующих этапов работы. Среди них может быть анализ коротких тандемных повторов, обнаружение однонуклеотидного полиморфизма, судебно-медицинская экспертиза, диагностика рака, диагностика наследственной патологии. Неизменной популярностью пользуется использование ffpe-блоков (фиксированные формалином животные (и человеческие) ткани заливают парафином и хранят десятилетиями) для хранения тканей и последующей экстракции, например, на магнитных частицах. Стоит отметить, что экстракция хорошего качества ДНК стала доступна относительно недавно после некоторой оптимизации протоколов выделения для очистки нуклеиновых кислот от молекул формалина. Молекулярный анализ тканей из ffpe-блоков может предоставить новые сведения для обнаружения биомаркеров многих патологий, например рака. Для выделения ДНК из ffpe-блоков необходимо:

• провести депарафинизацию — удалить парафин. Для этого используются растворители, например, ксилол, или нетоксичные вещества на масляной основе в сочетании с подогревом.
• отделение ДНК от других компонентов раствора.
• удаление белков, связывающихся с молекулами ДНК при фиксации парафином. Для этого используется инкубирование в термостате.
• собственно экстракция, например, при помощи мембраны из силиката или магнитных шариков [ 6 ].

Помимо очевидной необходимости в выделении ДНК человека для диагностики патологий и поиска путей для борьбы с ними, есть множество других целей для генетического анализа ДНК разных организмов, населяющих нашу планету. Например, необходимо найти способы остановить сокращение численности опылителей, в частности, пчел, что может привести к продовольственной катастрофе. Так, активно изучается механизм действия пестицидов на насекомых. Обнаружено, что воздействие токсичных для них веществ вызывает мутации в геноме и приводит к изменению важных генов, принимающих участие в регуляции питания, иммунитета и социального взаимодействия [ 7 ]. Другой важной задачей, стоящей перед учеными, стоит изучение ДНК организмов, проживающих на планете за много лет до нас.

Выделение нуклеиновых кислот из костей и окаменевших останков

Первая древняя ДНК была выделена в 1984 году из останков мышцы квагги (вымершей зебры), которые хранились в музее [ 8 ]. Полученная нуклеиновая кислота составляла всего 229 п.н.. Спустя около тридцати лет, исследователи начали выделять ДНК из образцов возрастом до 780000 лет [ 9 ]. Удалось полностью секвенировать геном шерстистого мамонта, пещерного медведя и неандертальцев [ 10, 11 ]. Активно изучаются образцы древних геномов людей, животных, растений и микробных сообществ. Но зачем же изучать ДНК, которая не только довольно сильно деградировала со временем, но и порой принадлежит тем, кого на планете уже нет ?

• Благодаря генетическим данным видов, проживающих в ту или иную эпоху, можно достаточно достоверно определить условия окружающей среды характерные для определенного периода.
• Ученые смогли открыть новые ветви в генеалогическом древе человека, например, добавив туда денисовцев. Также, удалось прояснить историю одомашнивания и перехода к сельскому хозяйству.
• Древняя ДНК помогла выяснить откуда произошли многие инфекционные заболевания, а также как они распространялись.
• Древняя ДНК помогает наиболее достоверным способом восстанавливать генеалогическое древо жизни на планете.

Все современные достижения в области изучения древней ДНК стали возможны благодаря совершенствованию методики секвенирования и выделения нуклеиновых кислот. Успех NGS в этой области заключается в способности проводить секвенирование и анализ миллионов локусов параллельно из небольшого количества ультракоротких фрагментов ДНК. Древнюю ДНК можно выделять из зубного камня, древесины, раковины моллюсков, пергамента, тканей, костей. Часто, к моменту попадания в лабораторию, исходные образцы сильно разрушен и загрязнены другими источниками ДНК: не только древними (например, бактериями, которые разлагали мясо на костях мамонта), но и современными источниками нуклеиновых кислот (привет бактериям-современникам и сотрудникам лаборатории). Поэтому особое внимание при работе с древней ДНК уделяется этапам очистки и концентрирования. Чтобы максимально сохранить целостность останков и сделать возможным дальнейший анализ, разработаны отдельные методики для взятия разных типов образцов, например, костей или растительных остатков. Прийти к итоговому результату анализа древней ДНК помогает оптимизация процесса на каждом из этапов. Для такой ДНК характерно небольшое количество и высокая степень фрагментации, когда некоторые "кусочки" ДНК насчитывают менее 100 п.н. (иногда всего 35 !) [ 12 ]. При работе с такими короткими фрагментами возникают сложности на этапе отделения их от фрагментов ДНК других видов и малых молекул, загрязняющих образец и способных сорвать всю последующую процедуру анализа (ПЦР, секвенирование). Еще одна особенность протоколов выделения ДНК из древних образцов — помимо ДНК можно сразу извлекать белки для радиоуглеродного или протеомного анализа. Так как материала для работы изначально мало, то приходится хитрить и объединять методики. В большинстве случаев образцы сперва механически измельчают до порошка, а затем инкубируют в буферном растворе для высвобождения ДНК. Буфер представляет собой раствор, способствующий разрушению солей кальция, расщеплению белков и липидов, что приводит к отделению нуклеиновых кислот от других молекул. Может быть добавлена еще одна стадия для удаления слабо связанных загрязнителей — обработка отбеливателем для удаления ингибиторов, либо поэтопное разложение и удаление экстрагированной фракции (самой загрязненной) [ 13, 14 ]. Однако, следует помнить, что ДНК изначально немного и некоторые этапы способствуют уменьшению и так небольшого количества необходимого материала. Методы, наиболее часто используемые для выделения древней ДНК, основаны на адсорбции молекул нуклеиновых кислот частицами кремнезема в буфере с хаотропными солями — на спин-колонках — или на магнитных шариках, покрытых кремнеземом [ 15 ]. Затем ДНК элюируют буфером с низким содержанием солей после промывки этанолом. Иногда добавляют стадию очистки фенол-хлороформом. Экстракты ДНК из древнего материала, как правило, представляют собой метагеномные комплексы, которые включают ДНК хозяина и связанных с ним микроорганизмов, а также ряда микроорганизмов из окружающей среды, которые колонизируют образец после его смерти [ 16 ]. Данные, полученные после экстракции ДНК из древних образцов имеют и историческую ценность. Например, недавно ученые проанализировали ДНК, выделенную из волос знаменитого композитора Людвига ван Бетховена и обнаружили, что он, вероятно, был болен гепатитом B, что и стало причиной смерти [ 17 ].

Выделение нуклеиновых кислот из бактерий и вирусов

Появление новых штаммов, преодоление межвидового барьера открывают пути для появления новых инфекционных заболеваний. Сотрудникам лабораторий то и дело приходится вновь оптимизировать протоколы выделения под новый объект. Выделять ДНК бактерий и вирусов можно из тканей зараженного человека, животного, растения … бактерии, что затрудняет процесс присутствием ДНК другого вида еще и в большем количестве. Выделение нуклеиновых кислот осуществляется путем щелочного лизиса с модификациями для отделения ДНК микробов от молекул хозяина при помощи спин-колонок. Помимо решения медицинских задач выделение нуклеиновых кислот может осуществлять из микробов почвы, воздуха, водоемов. Для этой процедуры используется сорбция ДНК на магнитных шариках.

Выделение нуклеиновых кислот из растений

Растения и микробы имеют специфические протоколы для извлечения ДНК. Растительные ткани содержат клеточные стенки и вторичные метаболиты, которые могут препятствовать выделению ДНК. Выделение нуклеиновых кислот из растительной ткани может стать настоящим вызовом творческому потенциалу сотрудника лаборатории, виной тому ингибирующие вещества — полисахариды, полифенолы, ДНКазы. И самое интересное, что от вида к виду их особенности и количество меняются, что может вынудить регулярно подгонять методику под конкретный объект. К тому же клеточная стенка растений отличается от животной. При работе с тканями растений исследователи предпочитают выделять ДНК из молодых растений, как правило они содержат меньше вторичных метаболитов. Однако, извлечение ДНК из гербария или мумифицированной ткани тоже распространенная практика. Наиболее частым объектом выделения являются листья. Анализ данных, полученных после работы с экстрагированной из растительных тканей ДНК, позволяет выяснить функции отдельных генов, играющих важную роль в жизни растения. Также исследования направлены на изучение эволюции и адаптационных особенностей растений, направленных на селекцию полезных для человека видов с их характерными особенностями. Как и в работе с другими объектами, экстракция ДНК из растений включает в себя несколько основных этапов: разрушение клеточной стенки и мембраны (лизис), отделение ДНК от других клеточных компонентов и последующая элюция. Наиболее используемым и универсальным считается выделение с использованием CTAB-буфера. Он хорошо справляется с высоким содержанием полисахаридов и полифенолов в растительных тканях. Микробные клетки, с другой стороны, малы и требуют эффективного лизиса клеток с использованием детергентов или ферментативного переваривания перед выделением ДНК.

Выделение нуклеиновых кислот при помощи спин-колонок

Первыми силикат при работе с ДНК использовали Б. Фогельштейн и Д. Гиллеспи в 1979 году [ 18 ]. Они выяснили, что нуклеиновые кислоты связываются с кремнеземом в растворе NaCl. Таким образом можно было отделить ДНК от других компонентов клетки. Это был первый шаг к появлению метода для экстракции, широко используемого в лабораториях по всему миру — спин-колонкам. Спин-колонка представляет собой метод твердофазной экстракции — для связывания определенных молекул используется твердый материал, он пропускает через себя одни вещества и задерживает другие. Сперва, как и во многих других подходах к выделению нуклеиновых кислот, используется буфер для лизиса. Он разрушает мембраны, позволяя молекулам оказаться за пределами клеточной оболочки. Среди прочих реагентов при экстракции используется протеиназа K, она расщепляет белки, ЭДТА — ингибирует ДНКазы. Помимо химического лизиса применяется физическое воздействие, а точнее температурное. Лизис может протекать в термостате, чаще всего используется температура около 50-55 градусов по Цельсию. Более высокая температура может привести к разрушению молекулы ДНК. Следом идет центрифугирование для удаления буфера и молекул в нем, которые для анализа не понадобятся. Теперь добавляется буфер для связывания, содержащий хаотропные соли (помогут ДНК связаться с силикатом) и этанол. Полученный раствор переносится в спин-колонку — пробирку с размещенной в ней мембраной из силиката. Далее следует центрифугирование, раствор будет проходить через мембрану, молекулы нуклеиновых кислот свяжуться с силикатом, а остальные компоненты раствора осядут на дно, после чего могут быть удалены из пробирки. Можно прибегнуть к дополнительной промывке буфером для связывания, чтобы удалить с мембраны лишние вещества. И последний этап — элюция, вымывание молекул ДНК. Для этого используется буфер для элюции, как правило с более высоким pH, чтобы ДНК могла отделиться от мембраны [ 19 ]. Спин-колонки позволяют на выходе получать ДНК высокого качества, также этот метод достаточно экономичен и не занимает много времени. Схема выделения ДНК в спин-колонке

Выделение нуклеиновых кислот при помощи магнитных частиц

Относительно "молодой" метод выделения — экстракция при помощи магнитных частиц (шариков). Отлично подходит для выделения как нуклеиновых кислот, так и белков. После лизиса в раствор добавляются магнитные микрогранулы, или магнитные шарики, на поверхность которых нанесен силикат. Связывание с силикатной поверхностью шариков следует по тому же принципу, что и с матрицей спин-колонок, в присутствии хаотропных солей (гуанидиний или тиоцианат). Внешний магнит создает магнитное поле, которое приводит к тому, что магнитные шарики с ДНК на поверхности отделяются от клеточного лизата. Пока магнитные шарики удерживаются магнитом следует удалить остальной раствор. Затем можно провести этапы промывки и элюции, для последнего необходима инкубация при 65 ° C для отделения ДНК от силиката. Использованные магнитные шарики могут быть вновь задействованы в процессе экстракции. Этот метод является масштабируемым, что делает его крайне удобным для использования в крупномасштабных процессах экстракции [ 20 ]. При этом нет необходимости в центрифугировании и сокращается число необходимых для работы буферных растворов. Нуклеиновые кислоты, получаемые при использовании такого метода, отличаются высоким качеством и концентраций [ 21 ]. Схема выделения ДНК с использованием магнитных частиц

Заключение

Выделение ДНК - важнейший процесс в молекулярной биологии и биотехнологических исследованиях. Качество выделенной ДНК часто определяет точность и надежность последующих приложений, таких как ПЦР, секвенирование, клонирование и анализ экспрессии генов. Экстракция ДНК включает в себя ряд этапов, направленных на выделение высококачественной геномной ДНК из различных типов образцов. Процесс включает в себя физическое разрушение клеток или тканей и последующую химическую обработку для высвобождения и очистки молекул ДНК. Еще одной критической особенностью выделения ДНК является использование соответствующих реагентов и ферментов. Для различных методов требуются специфические буферы, детергенты и протеазы, которые могут эффективно лизировать клетки и денатурировать белки. Качество и количество выделенной ДНК зависит от нескольких факторов, включая источник образца, эффективность метода выделения и наличие ингибиторов. Загрязнение другими веществами, такими как белки, полисахариды и гуминовые кислоты, может повлиять на последующие приложения, такие как ПЦР и секвенирование, мешая реакции амплификации или секвенирования. Поэтому очень важно оценить качество и концентрацию ДНК с помощью спектрофотометрии или гель-электрофореза, прежде чем приступать к последующей работе. Следует отметить, что выделение ДНК является важным этапом генетического анализа, исследования в области молекулярной биологии и биотехнологии, и диагностики. Выбор метода, оборудования и реагентов зависит от типа образца, последующего применения и требований к качеству. Оптимизация процесса выделения ДНК может привести к получению высококачественной ДНК, способной давать точные результаты. Прогресс в секвенировании привел к закономерному упрощению и ускорению процесса выделения нуклеиновых кислот для разных типов тканей. Все возможные варианты оптимизации направлены на увеличение концентрации ДНК надлежащего качества. Именно от этих двух параметров — качества и количества — ДНК будет зависеть успех дальнейших этапов работы, особенно секвенирования. Выделение нуклеиновых кислот — это самый первый этап работы с материалом в лаборатории, впереди еще много непростых методов, каждый из которым имеет множество особенностей. Познакомимся с ними в следующих материалах.

Источники

1. Ghaheri M. et al. A comparative evaluation of four DNA extraction protocols from whole blood sample// Cellular and Molecular Biology. – 2016. – Т. 62. 3. – С. 120-124.
2. Ali N. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics// BioMed research international. – 2017. – Т. 2017.
3. Paul R., Ostermann E., Wei Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases// Biosensors and Bioelectronics. – 2020. – Т. 169. – С. 112592.
4. Choi J. R. et al. based sample-to-answer molecular diagnostic platform for point-of-care diagnostics// Biosensors and Bioelectronics. – 2015. – Т. 74. – С. 427-439.
5. Zhang J. et al. A point of care platform based on microfluidic chip for nucleic acid extraction in less than 1 minute// Biomicrofluidics. – 2019. – Т. 13. 3. – С. 034102.
6. "Learn about DNA extraction from FFPE tissue in 10 minutes" BioChain (URL: https:// www.biochain.com ), дата доступа 12.05.2023
7. Schmehl D. R. et al. Genomic analysis of the interaction between pesticide exposure and nutrition in honey bees (Apis mellifera)// Journal of insect physiology. – 2014. – Т. 71. – С. 177-190.
8. Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family// Nature. – 1984. – Т. 312. 5991. – С. 282-284.
9. Orlando L. et al. Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse// Nature. – 2013. – Т. 499. 7456. – С. 74-78.
10. Palkopoulou E. et al. Complete genomes reveal signatures of demographic and genetic declines in the woolly mammoth// Current Biology. – 2015. – Т. 25. 10. – С. 1395-1400.
11. Barlow A. et al. Partial genomic survival of cave bears in living brown bears// Nature ecology & amp; amp; amp; evolution. – 2018. – Т. 2. 10. – С. 1563-1570.
12. Dabney J., Meyer M., Pääbo S. Ancient DNA damage// Cold Spring Harbor perspectives in biology. – 2013. – Т. 5. 7. – С. a012567.
13. Korlević P. et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth// Biotechniques. – 2015. – Т. 59. 2. – С. 87-93.
14. Gamba C. et al. Comparing the performance of three ancient DNA extraction methods for high ‐ throughput sequencing// Molecular Ecology Resources. – 2016. – Т. 16. 2. – С. 459-469.
15. Rohland N. et al. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones, teeth and sediments for high-throughput sequencing// Nature protocols. – 2018. – Т. 13. 11. – С. 2447-2461.
16. Orlando L., Gilbert M. T. P., Willerslev E. Reconstructing ancient genomes and epigenomes// Nature Reviews Genetics. – 2015. – Т. 16. 7. – С. 395-408.
17. Begg T. J. A. et al. Genomic analyses of hair from Ludwig van Beethoven// Current Biology. – 2023.
18. Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose// Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1979. – Т. 76. 2. – С. 615-619.
19. Martinez L. M., "Spin Column", Sepmag (URL: https:// www.sepmag.eu ), дата доступа: 12.05.2023
20. Martinez L. M., "Magnetic beads DNA", Sepmag (URL: https:// www.sepmag.eu ), дата доступа: 12.05.2023
21. Стоянова Э. Е., "Выделяем нуклеиновые кислоты: эволюция методов", Биомолекула (URL: https:// biomolecula.ru ), дата доступа: 12.05.2023